《Forbairt Cas13a/Cas12a-idirghabhála úrscéaldé "pota amháin" dé Measúnacht braite do bharra géinmhodhnaithe sainráite
Tá barra géinmhodhnaithe curtha go forleathan ar fud an domhain, agus tá go leor tíortha tar éis a mbearta rialála a fheabhsú de réir a chéile chun sábháilteacht na mbarr géinmhodhnaithe a chinntiú. Tá forbairt modhanna braite géiniteacha gasta agus cruinn ar an láthair an-tábhachtach do thalmhaíocht agus do bhithshábháilteacht, agus is féidir leo imní an phobail faoi tháirgí géinmhodhnaithe a mhaolú.
Sa staidéar seo, d'fhorbair an grúpa taighde imoibriú aon-phota nua -- MIRA dé-bhrath in éineacht le dé-CRISPR (modh MR-DCA) chun spriocanna géiniteacha CAMV35S agus NOS a bhrath go comhuaineach i mbarr géin atá modhnaithe go géiniteach, ag soláthar modh braite simplí agus éifeachtach chun barraí modhnaithe a bhrath.
Modhanna turgnamhacha
Déantar anailís ar dhé-tháirge Mira ag CAS13A agus CAS12A dé-chóras chun dhá chomhartha neamhspleácha a ghiniúint nach gcuireann isteach ar a chéile, agus ansin léitear an dath fluaraiseacha le hionstraim soilsithe nó le stiall tástála le dhá líne T chun ath-chainéal dé-chainéil a bhaint amach. Tá an próiseas iomlán críochnaithe i níos lú ná 35 nóiméad, le teorainn braite chomh híseal le 20 cóip.
(Prionsabal Braite MR-DCA CAMV35S agus NOS)
Tá an turgnamh iomlán roinnte i dtrí chéim: aimpliú Mira, imoibriú CRISPR, agus dhá mhodh léirmhínithe torthaí.
Úsáidtear géine CAMV35S mar sprioc Cas13a, agus úsáidtear an ghéin NOS mar sprioc Cas12a. Dearadh dhá phéire primers Mira faoi seach. Ní aithníonn an córas CAS13A ach RNA, mar sin tá an réigiún primer ar aghaidh deartha, ina bhfuil tionscnóir T7 le haghaidh trascríobh agus gníomhachtú Cas13a ina dhiaidh sin. Cuirtear PAM leis an ngéin NOS. Cinntíonn na breiseanna thuas gur féidir le próitéiní Cas13a agus Cas12a araon ceangal a dhéanamh lena gcrnanna faoi seach, agus níl aon chur isteach ná tras-imoibriú idir an dá chóras.
Staid thurgnamhach
Íogaireacht agus sainiúlacht
Rinneadh an sampla a chaolú i ngrádán chun déine fhluaraiseacht an imoibriú Mira a thástáil. Fuarthas amach go bhféadfaí an déine fluaraiseachta a bhrath fós ag tiúchan samplach de 20 μL. Roghnaíodh an tiúchan de 20 μL ar deireadh don turgnamh.
(Úsáidtear comhchruinnithe samplacha agus stiallacha tástála éagsúla le haghaidh forbairt datha agus ríomh cainníochtaithe déine)
Chun meastóireacht bhreise a dhéanamh ar shainiúlacht MR-DCA, rinne an fhoireann taighde tástáil ar shamplaí measctha d'ainmhithe neamh-thrasghineacha agus de phlandaí neamh-thrasghineacha. Léirigh na torthaí nach raibh comharthaí fluaraiseachta ard ag samplaí trasghineacha ina raibh CaMV35S agus NOS, agus go raibh déine fluaraiseachta na samplaí eile gar don rialú diúltach. Is féidir MR-DCA a úsáid mar ardán braite aigéid núicléasaigh dé-spriocdhírithe.
Rinne MR-DCA tástáil ar 24 sampla barr. Ina measc, tá 1, 2, 15, 16, 21, agus 22 ina n -arbhar transgenic ina bhfuil tionscnóir CAMV35S. Tá 7, 8, 23, agus 24 rís transgenic atá frithsheasmhach in aghaidh galair ina bhfuil Terminator NOS. Is iad 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17, agus 18 pónaire soighe trasghineacha ina bhfuil tionscnóir camv35s agus terminator NOS.
(Torthaí tástála de 24 sampla)
Freagairt thapa
Is fachtóir tábhachtach é an t-am imoibriúcháin i mbrath ar an láthair. Thug an fhoireann taighde faoi deara go bhféadfaí comharthaí fluaraiseachta FAM agus Hex a bhrath le hionstraim fhluaraiseacht nuair a bhí an t -am imoibriúcháin 10 nóiméad. Bhreathnaigh Mira in éineacht le himoibriú CRISPR freisin ar fhluaraiseacht bhuí tar éis 15 nóiméad.
(Comhartha fluaraiseachta ag amanna imoibriúcháin éagsúla Mira)
(Forbairt datha na stiallacha tástála ag amanna imoibriúcháin éagsúla Mira agus an ríomh cainníochtaithe déine)
Conclúid Thurgnamhach
Léirigh na torthaí turgnamhacha go bhfuil dea -shainiúlacht ag an dé -Mira agus gur féidir leis na táirgí aimplithe camv35s agus uimhreacha a fháil go cruinn. Imoibríonn na córais CAS13A agus CAS12A go neamhspleách gan cur isteach ar a chéile. Is féidir leis an tástáil MR-DCA 20 cóip a bhrath go cruinn ag teocht íseal de 35 nóiméad, a bhfuil luach mór aige maidir le barra géinmhodhnaithe sa pháirc a bhrath.
Eolas Airteagal
Ainm na hirise: 《Journal of Advanced Research Express
Teideal an Airteagail: 《Forbairt ar Núíosach Cas13A/CAS12A-Measúnacht Braite Dé-Bhraite do Bharr Géiniteach atá modhnaithe go sainráite
Fachtóir Tionchair: 11.4
Foireann Taighde: Wang Xiaofu, Acadamh Eolaíochtaí Talmhaíochta Zhejiang Zhejiang